心肌细胞动作电位|离子通道筛选|膜片钳检测|全细胞电流钳

北京向新立生物：大鼠心肌膜片钳检测技术突破，为心脏靶点药物研发提供高精度数据支撑

北京向新立生物医药有限责任公司（简称“向新立生物”）基于改良Langendorff主动脉逆行灌流酶解法，可稳定分离出存活率高达60%以上的成年大鼠心肌细胞，结合标准化膜片钳检测平台，能够精准记录心肌细胞动作电位（AP）关键参数（静息电位-70~-80mV，APD90 100-150 ms），为离子通道靶点筛选、心脏毒性评估及心血管药物药效学评价提供一站式、可追溯、符合行业标准的电生理检测服务。

一、应用场景直击药物研发痛点

在心血管药物研发及安全性评价中，心肌细胞动作电位（AP） 直接反映药物对钠、钙、钾等多个离子通道靶点的综合作用。传统的hERG检测仅关注单一通道，而膜片钳检测大鼠心肌AP能够：

· 靶点覆盖更全面：同时检测INa、ICaL、Ito、IKr、IKs、IK1等多电流贡献，避免“假阴性/假阳性”风险；

· 临床转化相关性高：大鼠心肌电生理特性与人类高度同源，尤其适用于心律失失常风险预测；

· 数据可量化：输出静息电位（RMP）、动作电位幅值（APA）、最大上升速率（Vmax）、复极化时程（APD00/50/90）等十余项定量指标。

向新立生物依托上述技术，已为多家创新药企提供靶点验证与心脏毒性筛选服务，累计完成超过2000个化合物的电生理评价。

二、核心技术一：高活性大鼠心肌细胞分离工艺（数据支撑）

细胞质量是膜片钳检测成功的“第一道关”。向新立生物采用改良Langendorff灌流+三步梯度复钙工艺，关键质控数据如下：

# 2.1 分离流程关键参数

| 步骤 | 关键条件 | 质控指标 |

| 主动脉灌流 | 恒流泵 3 mL/min，37°C | 排血完全，心脏自发搏动停止 |

| 酶消化液 | Ⅱ型胶原酶 1 mg/mL + 牛磺酸 + BSA | 消化时间约15-20 min，心脏呈发白松软 |

| 细胞纯化 | 6% BSA沉降 + 无血清MEM清洗 | 去除死细胞及碎片 |

| 复钙方案 | 三步梯度复钙（0.2→0.5→1.0 mM Ca²⁺） | 细胞存活率较一步法提升35% |

# 2.2 细胞产量与活性数据

· 心室肌细胞：每只成年SD大鼠心室可获得 (5-8)×10⁶ 个长杆状心肌细胞；

· 质量良好细胞占比：约 90%（横纹清晰、边缘锐利、无自主收缩）；

· 复钙后存活率：约 60-70%，远高于传统两步法（<40%）；

· 心房肌细胞（需结扎处理）：每只可获得 (7.5±1.4)×10⁶ 个，复钙至1 mM Ca²⁺后形态稳定率 80%。

影响存活率的关键因素（内部实验数据，n=30只大鼠）：

✅ 灌流液pH 7.35-7.40 → 存活率最高

✅ 灌流速度3 mL/min → 细胞得率峰值

❌ 直接一步复钙 → 存活率下降50%以上

三、核心技术二：标准化膜片钳检测流程及动作电位记录规范

向新立生物采用全细胞电流钳模式记录大鼠心室肌细胞动作电位，所有操作遵循国际电生理学会推荐标准。

# 3.1 实验系统配置

| 设备/软件 | 型号/版本 | 用途 |

| 放大器 |HEKA EPC10 | 电流钳/电压钳切换 |

| 拉制仪 | P-1000 | 玻璃微电极（电阻2-5 MΩ） |

| 显微镜 Olympus IX71 | 倒置+红外DIC | 细胞形态筛选 |

# 3.2 关键记录参数（标准化模板）

| 参数 | 设定值 | 说明 |

| 刺激模式 | 逐次刺激（Episodic stimulation） | 频率1 Hz |

| 刺激电流 | 2 ms 方波，强度约500 pA | 诱发单动作电位 |

| 滤波 | 6 kHz | 去除高频噪声 |

| 浴槽温度 | 35±1°C | 恒温灌流 |

| 细胞外液 | 有钙台氏液（Ca²⁺ 1.8 mM） | pH 7.4 |

| 电极内液 | 高钾内液（KCl ~140 mM） | pH 7.2 |

# 3.3 动作电位特征参数正常范围（向新立生物内部质控标准，n=50个细胞）

| 参数 | 缩写 | 正常范围（1 Hz刺激） | 生理意义 |

| 静息膜电位 | RMP | -75 ~ -80 mV | 主要反映内向整流钾通道（IK1）功能 |

| 动作电位幅值 | APA | 110 ~ 130 mV | 钠通道（INa）功能完整性 |

| 最大上升速率 | Vmax | 150 ~ 250 V/s | 钠通道激活速度 |

| 复极化30%时程 | APD30 | 15 ~ 3 0ms | 早期复极（Ito） |

| 复极化50%时程 | APD50 | 40 ~ 70 ms | 钙-钾电流平衡 |

| 复极化90%时程 | APD90 | 100 ~ 150 ms | 主要反映延迟整流钾通道（IKr/IKs） |

质控放行标准：RMP < -70 mV，APA > 100 mV，且连续记录10 min无参数漂移超过10%。

四、数据应用案例：如何利用膜片钳检测结果指导药物靶点判断

# 案例1：某创新钾通道激动剂（化合物X）

背景：拟开发用于短QT综合征，需验证其对IKr/IKs的选择性

向新立生物检测结果（n=9个细胞，均值±SD）：

| 参数 | 对照组 | 化合物X (1 μM) | 变化率 |

| APD90 (ms) | 132 ± 8 | 78 ± 6** | -41% |

| APD50 (ms) | 58 ± 5 | 31 ± 4** | -47% |

| RMP (mV) | -81 ± 3 | -80 ± 2 | 无变化 |

结论：化合物X显著缩短APD90且不影响静息膜电位，提示强效激活IKr/IKs，符合预期靶点机制，推进至临床前安全性评价。

# 案例2：某候选药物意外发现QT间期延长风险

背景：酶学筛选无hERG抑制，但动物心电图显示QT延长。

向新立生物膜片钳检测发现：

· 低浓度（0.1 μM）下APD90延长22%（p<0.05）；

· 高浓度（1 μM）下诱发早期后除极（EAD）样波形，且Vmax下降30%。

结论：该药物除抑制IKr外还轻度抑制钠通道，传统hERG检测未能捕捉，膜片钳检测大鼠AP可更全面预警心律失常风险。

五、北京向新立生物医药检测优势

| 对比维度 | 传统CRO或内部检测 | 

| 细胞活性 | 复活率常<40% | 三步复钙工艺，存活率≥60% |

| 数据完整性 | 仅提供APD90等1-2项参数 | 输出RMP/APA/Vmax/APD20/50/90等≥8项指标 |

| 实验周期 | 下单后的10个工作日 | 标准化流程，7个工作日内出具报告 

| 靶点解析能力 | 单一参数，难以区分通道 | 结合特异激动剂/抑制剂，可区分INa/ICaL/IKr/IKs贡献